search for




 

Production of doubled haploid population derived from the microspore culture of rapeseed (Brassica napus L.) F1 generation and analysis of fatty acid composition
J Plant Biotechnol 2022;49:74-81
Published online March 31, 2022
© 2022 The Korean Society for Plant Biotechnology.

Ji Eun Lee ・Ju Hyun Park ・Kwang Soo Kim ・Da Hee An ・Young Lok Cha

(Bioenergy Crop Research Institute, National Institute of Crop Science, RDA, 199 Muanro, Cheonggye, Muan, Jeonnam, Republic of Korea)
Correspondence to: e-mail: leejins212@korea.kr
Received November 20, 2021; Revised December 24, 2021; Accepted December 24, 2021.
cc This is an Open-Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.
Abstract
Brassica napus, an oil crop that produces rapeseed oil, is an allotetraploid (AACC, 2n = 38) produced by natural hybridization between B. rapa and B. oleracea. In this study, microspore was cultured using the F1 developed from a cross between ‘EMS26’ line with high oleic acid content and ‘J8634-B-30’ lines. The flower bud size showing the nuclear development at the late uninucleate and binucleate stage with high embryogenesis rate was 2.6 ~ 3.5 mm. Microspores were cultured using only this size and after then most microspore embryo developed into secondary embryos and then regeneration plants obtained from the developed multilobe. The analysis of the ploidy of the plants revealed that 66.7% and 27.8% of the total lines were tetraploids and octoploids, respectively. The sizes of stomatal cells in tetraploids, octoploids, and diploids were 25.5, 35.6, and 19.9 μm, respectively, indicating that ploidy level was positively correlated with cell size. Furthermore, 62 tetraploid doubled haploid (DH) lines were selected. The average oleic acid (C18:1) and linolenic acid (C18:3) concentrations of DH were 72.3% and 6.2%, respectively. Oleic acid and linolenic acid concentrations exceeded the two parental values in 5 and 14 DH lines, respectively, suggesting that these two fatty acids had transgressive segregation. Therefore, the DH population can be utilized for the biosynthesis of unsaturated fatty acids in rapeseed and related genes. It can also be used as a breeding material for varieties with high oleic acid concentrations.
Keywords : Rapeseed, Microspore culture, Doubled haploid, Fatty acid composition, Ploidy
서 론

작물 육종에서 배가반수체(Doubled haploid, DH) 생산 기술은 기존 전통 육종과 비교하여 동형접합 계통(Homozygous inbred lines)을 짧은 기간 내 얻을 수 있는 기술이다(Forster and Thomas 2005). 또한 형질을 짧은 시간 내에 확인하고 고정할 수 있기 때문에 선발 효율도 뛰어나다(Sanpe 1997). 이러한 배가반수체 식물은 반수체를 획득하여 콜히친 등을 처리하고 염색체를 배가시켜 100% 동형 접합자인 배가반수체를 만들어 얻을 수 있다(Mohammadi et al. 2012; Weber et al. 2005). 독말풀(Datura innoxia)에서 처음으로 약배양을 통해 반수체 식물체를 얻은 이래로, 유채, 담배, 밀 등에서 약배양에 성공하여 반수체를 획득하였다(Guha and Maheshwary 1964; Nakata and Tanaka 1968; Ouyang et al. 1973; Thomas and Wenzel 1975). 소포자 배양을 통한 반수체 식물체 생산은 유채(Licher 1982)에서 처음 보고되었으며, 이후, 담배(Kyo and Harada 1985), 보리(Datta 2001) 등에서 보고되었다. 소포자 배양은 체세포 유래 세포와 소포자 유래 세포가 혼재되어 있는 약배양에 비해 소포자 세포만을 사용하며, 약배양에 비해 배발생 비율이 높다는 장점이 있다(Siebel and Pauls 1989). 특히 유채, 사과에서는 약배양에 비해 소포자배양에서 배 발생 비율이 10배가 높다고 보고되었다(Höfer 2004; Siebel and Pauls 1989).

유채(Brassica napus)는 약 7,500년 전 배추(Brassica rapa, AA, 2n = 20)와 양배추(Brassica oleracea, CC, 2n = 18)의 자연 교잡(Natural hybridization)에 의해 만들어진 이질사배체(AACC, 2n = 38) 작물이다(Chalhoub et al. 2014). 또한 유채는 전 세계적으로 콩에 이어 연간 6-7천만톤의 유채유를 생산하는 가장 주요한 유지 작물이다(Long et al. 2018). 유채유는 대부분 올레산(Oleic acid, C18:1), 리놀레산(Linoleic acid, C18:2), 리놀렌산(Linolenic acid, C18:3)과 같은 불포화된 지방산으로 이루어져 있다. 이러한 유채유의 조성 중 높은 올레산 비율을 갖는 것은 많은 이점을 가져다 준다. 특히 유채유 산패를 줄여 보관 기간을 길어지게 하며(Browse et al. 1998; Przybylski et al. 2013), 섭취 시 저밀도 지질단백질 수준을 감소시키고 심혈관 질환의 위험을 감소시킨다(Chang and Huang 1998; WHO 2003). 또한 올레산 비율이 높은 올리브유를 대체할 수 있어 가격 면에서 경쟁력을 가질 수 있다(Long et al. 2018).

유채에서는 배가반수체 생산을 통한 계통 육성이 다수 보고 되어왔는데, 특히 인위적인 돌연변이 유발을 통해 얻은 올레산 비율이 높은 계통(70% 이상)과 일반 계통(60~65%)을 교배하여 얻은 잡종 1세대로부터 약, 소포자 배양을 통해 배가반수체 유전 집단을 확보하여 관련 마커를 개발하는 연구가 활발히 진행 중이다(Hu et al. 2006; Javidfar et al. 2006; Yang et al. 2012). 특히 Gecek 등(2017)은 반수체 배양으로 얻은 배가반수체(DH) 60계통을 대상으로 종자 내 지방산 생합성과 관련된 GWAS (Genome-Wide Association) 연구를 실시하였으며, 올레산과 연관된 유전자좌가 A05 염색체에 존재한다고 밝혔다. 국내에서는 인위적인 돌연변이를 유발한 유채 M2 세대(Kim et al. 2008)와 ‘탐미유채’(Kim et al. 2012) 등의 유채 품종에서 효율적인 소포자 배양 조건을 설정하여 반수체 식물체를 얻는 연구가 보고된 바 있다. Park 등(2006)은 ‘탐라유채’, ‘한라유채’ 등 8개의 품종을 대상으로 반수체 식물 유도 효율을 확인하였으며, 각 품종에 따라 배발생을 유도하는 배지 조건과 배 발생능이 달랐고 탐라 품종에서 가장 높은 반수체 배 생산능을 보였다고 보고하였다. 따라서 본 연구는 소포자 배양 기술을 이용한 배가반수체 집단을 육성하여 유채 종자 내 올레산 함량의 증가 가능성을 확인하고자 올레산 함량이 높은 EMS26 계통과 J8634-B-30 계통을 인공교배하여 잡종 1세대를 얻었으며, 잡종 1세대의 적정 꽃봉오리 크기를 확인하고 소포자 배양을 실시하였다. 이후 소포자 배양에서 유래한 식물체의 배수성을 확인하고 배가반수체 계통을 선발하여 지방산 조성 등을 분석하였다

재료 및 방법

시험 재료

본 시험은 종자의 지방산 조성 중 올레산이 70% 이상을 차지하는 고올레산 유채 계통 ‘EMS26’을 모본으로, 올레산 함량이 60% 정도인 ‘J8634-B-30’ 계통을 부본으로 하여 교배한 F1 계통을 사용하였다. F1 계통은 비닐하우스 내에서 온도를 주간 20~25°C, 야간 10°C로 조절하여 재배하였다.

소포자 핵 발달 관찰 및 소포자 배양

적절한 소포자 단계를 선별하기 위해 꽃봉오리의 크기에 따라 소포자 핵의 발달 과정을 관찰하였다. 꽃봉오리의 크기는 2.0 mm 이하, 2.1~2.5 mm, 2.6~3.0 mm, 3.1~3.5 mm, 3.6~ 4.0 mm, 4.1 mm 이상으로 분류하였으며, Carnoy’s 용액(Aectic acid : Ethyl-alcohol, 1:3)에 고정 후 DAPI (4’-6-Diamidino-2-phenylindole) 염색을 통해 형광현미경(Carl zeiss, AX10, Germany)으로 관찰하였다.

소포자 배양은 Kim 등(2012), Na 등(2011), 그리고 Seo 등(2014)의 방법을 참고하여 수행하였다. 선별된 크기의 꽃봉오리에 B5 (Sucrose 13%) 배지를 첨가 후 마쇄하고 45 μm nylon mesh로 여과시켜 24/32/40%의 percoll을 이용하여 농도 구배를 만들었다. 이후 32% percoll층에 분리된 소포자만을 수집하여 배양 밀도가 5 × 104 개/ml가 되도록 1 mg/L NAA (α-Naphthalen acetic acid)와 0.05 mg/L BA (6-Benzyl amino purine)이 포함된 1/2 NLN 배지(Sucrose 13%)에 현탁하여 배양하였다. 초기 배양은 3일간 암상태에서 34°C로 3일간 열 처리한 후, 25°C에서 암배양하였다.

배양 후 형성된 소포자배는 MS (Murashige and Skoog 1962) 고체 배지(Sucrose 3%, Agar 0.75%)에 치상하여 27°C에 16 h/day 광주기로 배양하였다. 이후 발생한 캘러스, 절취한 신초 또한 동일한 배지와 조건에서 계대 배양하였다. 재분화된 식물체는 온실에서 순화 과정을 거쳐 약 2~3주 후 주간 20~25°C, 야간 10°C로 조절되는 비닐하우스 내에 이식하여 재배하였다.

재분화 식물체 배수성 검정 및 세포 크기 측정

재분화된 식물체의 배수성 검정은 Atri와 Banga (2016)의 방법을 변형하여 수행하였다. 비닐하우스에 이식된 식물체의 어린 잎을 채취하여 약 0.5 cm2 면적의 잎을 잘라 잘게 CyStain UV precise P (Partec, Germany) kit를 이용하여 DNA를 추출하고 염색(DAPI)하였다. 추출한 DNA는 cyflow ploidy analyzer (Partec, Cyflow Cube 6, Germany)로 배수성을 검정하였다. 배수성은 기존의 모본과 부본 계통 대비 재분화 식물체의 형광강도(fluorescence intensity)를 확인하여 검정하였다.

식물체의 세포 크기는 기공 세포의 세로 길이를 측정하여 조사하였다. 본엽이 7~8매 자란 식물체의 잎을 채취해 잎 뒷면의 표피를 벗긴 후, 슬라이드 글라스 위에 증류수를 떨어뜨려 광학현미경(Carl zeiss, AX10, Germany)으로 관찰하였다. 기공 세포의 크기는 닫혀진 기공을 기준으로 세로 길이를 측정하여 식물체 당 5반복으로 조사하였다.

배가반수체 집단 지방산 조성 분석

배가반수체로 선발된 유채 계통을 대상으로 종자의 지방산 조성을 Lee 등(2014)의 방법을 참고하여 분석하였다. 종자 0.3 g을 분쇄하여 methyl alcohol 15 ml와 30% sodium methoxide 1 ml을 넣고 78°C에서 methylation 시킨다. 이후 n-hexane 을 넣고 추출하여 상층액을 0.2 μm 필터로 필터 후, GC (Gas chromatography, Agilent, 7890A, USA)로 분석하였다. 분석 컬럼은 fused silica capillary column (Agilent, 122-2232, 30 X 0.25 mm, 0.25 μm, 7 inch cage)를 사용하였으며, 오븐 온도는 초기 100°C에서 1분 후, 분당 8°C씩 상승시켜 250°C에서 5분간으로 유지시켰다. Detector gas는 hydrogen (30 ml/min), 온도는 250°C 조건으로 분석하여 각 peak의 면적에 비하여 각 지방산의 비율을 상대적인 백분율로 표기하였다.

결과 및 고찰

유채 잡종 1세대의 소포자 배양

효과적인 소포자 배양을 실시하기 위해, ‘EMS26’과 ‘J8634-B-30’ 인공교배 잡종 1세대의 꽃봉오리 크기에 따른 소포자 핵의 발달 과정을 관찰하였다(Fig. 1). 크기가 가장 작은 2.0 mm 이하 꽃봉오리의 소포자는 거의 4분자기 상태였으며, 2.1~2.5 mm 꽃봉오리에서도 거의 대부분 사분자기와 일부 소포자에서는 1핵기 초기 발달 단계였다. 2.6~3.0 mm 크기 꽃봉오리에서는 전체적으로 1핵기 단계였으며 일부 2핵기 초기 단계를 보였다. 3.1~3.5 mm 꽃봉오리에서는 1핵기 말에서 2핵기 상태가 주를 이루었으며, 3.6~4.0 mm에는 2핵기 단계가 주를 이루었고 3핵기가 일부 관찰되었다. 4.1 mm 이상의 가장 큰 꽃봉오리에서는 생식핵과 영양핵을 동시에 갖는 3핵기 상태가 대부분이었다.

Fig. 1. Nuclear development stage of microspore according to the flower bud sizes of rapeseed F1. Binucleate stage presenting vegetative and generative nuclei. Trinucleate stage presenting one vegetative and two generative nuclei

유채는 품종에 따라 소포자 배양에 효과적인 꽃봉오리 크기가 달랐다. ‘한라유채’는 2.5~3.0 mm, ‘내한’유채’은 3.0~3.5 mm, ‘탐라유채’는 3.5~4.0 mm 꽃봉오리에서 소포자 배 발생 빈도가 가장 높았다(Kim et al. 2008; Park et al. 2006). 본 꽃봉오리 크기의 소포자 발달 상태는 모두 1핵기 말에서 2핵기 초기로 배 발생에 적합한 핵 발달 시기였다. 3핵기 이상의 소포자로 배양 된 소포자 배는 다핵성 세포구조로 발달하였으며, 4분자기의 소포자는 세포 팽창과 세포 분열이 전혀 일어나지 않는다고 보고되었다(Jang et al. 1997; Kim et al. 2012). 이에 본 시험에서도 소포자 핵이 1핵기 말에서 2핵기의 발달 단계를 보이는 2.6~3.5 mm 크기의 꽃봉오리를 이용하여 소포자 배양에 사용하였다.

소포자배 발생을 촉진시키는 고온 처리 후, 소포자 배양 2일차에서는 세포의 크기가 커지는 팽윤 현상을 보였으며(Fig. 2A, B), 배양 10일차에는 육안으로 관찰 가능한 구형배, 심장형배가 관찰되었다(Fig. 2C, D). 이후 어뢰형배 시기에 소포자배를 고체 MS 배지에 치상하여 암배양 조건에서 광배양 조건으로 옮겨 광 순화를 진행하였다(Fig. 2E, F). 광순화가 진행된 소포자배는 일부 자엽으로 발달되고 뿌리가 신장하여 정상적인 식물체를 얻을 수 있었지만(Fig. 3A), 대부분의 소포자배는 캘러스가 형성되면서 다수의 2차배 발생이 관찰되었다(Fig. 3B). 이후 발생된 2차배를 계대배양하게 되면 비대된 multilobe가 발생하고 다량의 신초가 발달하였다(Fig. 3C). 형성된 신초는 기저부를 절단하여 동일한 MS 배지에서 배양하였고 캘러스 형성없이 뿌리가 유도된 식물체를 얻을 수 있었다(Fig. 3D).

Fig. 2. Embryogenesis from the isolated microspore culture of rapeseed F1. (A) Isolated microspores. (B) Embryogenesis derived from microspores after 2 days of culture. (C and D) Globular-stage embryo after 10 days of culture. (E and F) Maturated embryo after 2 days of culture in light acclimation

Fig. 3. Shoot regeneration derived from the embryo. (A) First early shoot and root formation derived from the embryo. (B) Multilobe formation from the secondary embryo. (C) Shoot formation from the multilobe. (D) Regenerated plantlet

유채의 여러 품종에서 소포자 배양 결과가 보고되었다. ‘탐미유채’ 와 ‘MS-B line’ 품종에서는 소포자배에서 바로 뿌리가 발달하여 식물체를 형성하였으며, ‘탐라유채’와 ‘목포68호’ 품종에서는 캘러스 형성 후 multilobe로 발달하였다(Park et al. 2006). 또한 Kim 등(2008)은 양성자 및 감마선을 처리한 ‘한라유채’, ‘내한유채’ ‘탐미유채’ 품종에서 대부분 multilobe를 형성한다고 보고하여, 우리의 소포자 배양 결과 또한 품종에 따른 결과로 사료된다.

재분화 유채 배수성 검증

재분화된 식물체는 순화 과정을 거쳐 온실로 옮겨졌으며, 성공적으로 이식된 유채 108개 계통을 대상으로 배수성을 검정하였다. 재분화 식물체의 배수성을 검정하기 위해, 부본인 J8634-B-30과 모본인 EMS26 계통의 유세포 분석(flow cytometry)을 실시하였다. 두 계통 모두 상대적 형광 강도(flouorescence intensity)가 약 200 가량에서 peak를 보였으며, 이를 4배체 기준으로 두고 각 재분화 식물체의 배수성을 판별하였다(Fig. 4A). 108개의 계통 중 4배체는 DH47계통을 포함하여 72계통으로 전체 계통 중 66.7%를 차지하였으며, 8배체는 DH21계통을 포함하여 30계통으로 27.8%였다. 마지막으로 2배체 식물체는 DH15계통을 포함하여 6계통으로 5.6%였다(Table 1).

Ploidy and stomatal size of rapeseed lines from the isolated microspore culture of F1

Line Ploidy Stomatal size (μm) Line Ploidy Stomatal size (μm) Line Ploidy Stomatal size (μm)
DH1 4 22.3±0.36 DH37 4 22.4±0.34 DH74 4 27.0±0.25
DH2 4 28.4±0.20 DH38 4 30.6±0.43 DH75 8 29.9±0.53
DH3 4 26.3±0.22 DH39 8 41.2±0.40 DH76 4 24.4±0.35
DH4 4 25.2±0.71 DH40 4 30.5±0.23 DH77 4 26.3±0.28
DH5 4 25.4±0.22 DH41 8 29.7±0.29 DH78 8 27.2±0.85
DH6 8 37.9±0.67 DH42 4 29.8±1.19 DH79 2 27.7±0.29
DH7 8 35.3±0.68 DH43 4 25.4±0.24 DH80 4 25.9±0.23
DH8 8 35.6±0.42 DH44 4 24.6±0.31 DH81 8 41.2±1.06
DH9 4 26.3±0.91 DH45 8 28.1±0.97 DH82 8 44.4±0.31
DH10 4 19.0±0.63 DH46 4 23.5±0.28 DH83 4 28.6±0.35
DH11 4 25.8±0.24 DH47 4 23.7±0.45 DH84 8 37.8±0.73
DH12 8 36.2±0.43 DH48 4 29.7±0.11 DH85 4 27.1±0.41
DH13 4 23.4±0.20 DH49 4 26.1±0.56 DH86 4 25.5±0.32
DH14 4 24.4±0.25 DH50 8 30.0±0.30 DH87 4 25.1±0.35
DH15 2 20.1±0.20 DH51 2 12.2±0.30 DH88 4 26.3±0.34
DH16 8 36.9±1.42 DH52 4 26.0±0.33 DH89 8 45.1±0.67
DH17 4 22.6±0.25 DH53 8 34.1±0.47 DH90 8 34.1±0.58
DH18 4 24.3±0.11 DH54 4 25.8±0.23 DH91 2 17.9±0.61
DH19 4 24.6±0.54 DH55 4 27.5±0.30 DH92 4 23.6±0.06
DH20 4 23.7±0.15 DH56 4 22.3±0.16 DH93 4 21.4±0.36
DH21 8 32.3±1.04 DH57 4 21.7±0.25 DH94 4 30.4±0.21
DH22 4 25.7±0.33 DH58 4 29.7±0.36 DH95 4 26.0±0.37
DH23 4 25.0±0.29 DH59 4 24.5±0.51 DH96 4 28.3±0.34
DH24 8 34.7±0.08 DH60 8 29.4±0.64 DH97 8 40.1±0.27
DH25 4 22.3±0.29 DH61 4 18.3±0.05 DH98 4 26.4±0.35
DH26 8 25.5±0.38 DH62 4 24.3±0.29 DH99 4 29.1±0.22
DH27 4 27.7±0.12 DH63 8 36.5±0.22 DH100 4 26.2±0.33
DH28 4 24.6±0.18 DH64 4 31.2±0.51 DH101 4 25.0±0.36
DH29 4 27.3±0.27 DH65 8 37.2±0.36 DH102 8 50.4±0.45
DH30 4 24.6±0.24 DH66 4 21.9±0.28 DH103 8 23.9±0.82
DH31 2 21.8±0.26 DH67 4 31.5±0.35 DH104 4 26.1±0.20
DH32 4 22.7±0.19 DH68 4 23.2±0.40 DH105 4 32.8±0.76
DH33 8 36.8±0.34 DH69 4 27.0±0.33 DH106 2 20.0±0.36
DH34 8 39.6±0.54 DH70 4 25.3±0.70 DH107 4 26.0±0.41
DH35 8 36.5±0.35 DH72 4 22.9±0.53 DH109 4 18.7±0.50
DH36 4 22.9±0.46 DH73 8 40.8±0.68 DH110 4 26.1±0.89


Fig. 4. Flow cytometric analyses (A) and stomatal cell (B) of rapeseed lines from the isolated microspore culture of F1. (A) The ploidy of each peak is indicated on top. (B) The white line indicated 30 μm

식물체의 배수성과 세포의 크기는 연관 되어있으며, 특히 기공 세포의 길이는 배수성이 커질수록 길어진다고 알려져 있다(Tatum et al. 2006; Thomson et al. 2002). 이에 재분화 108 계통의 식물체 기공 세포의 길이를 측정하였다(Fig. 4B). DH82 계통을 포함하는 8배체의 평균 세포 크기는 35.6 μm로 DH102계통에서 50.4 μm로 가장 크게 관찰되었다(Table 1). DH18계통을 포함하는 4배체 식물체의 평균 세포 크기는 25.5 μm였으며, DH15계통을 포함하는 2배체는 19.9 μm로 DH51계통에서 12.2 μm로 가장 작았다. 재분화 식물체의 배수성과 세포 크기와의 상관 계수인 R2 값은 0.616으로 정의 상관관계를 보였다(Fig. 5).

Fig. 5. Stomatal size versus ploidy level in rapeseed lines from the isolated microspore culture of F1. The black dot line indicated the trend line

반수체 배양 후 배가반수체 식물을 얻기 위해서는 일반적으로 콜히친을 처리하여야 한다(Mohammadi et al. 2012; Weber et al. 2005). 그러나 소포자 배양 조건에 따라 캘러스 형성 후 2차배 발달 단계를 거치게 되면 배가반수체 식물의 비율이 70% 이상으로 높아지는 결과를 보이기도 하였다(Keller and Armstrong 1979; Shumilina et al. 2020). 이러한 자발적인 배가반수체 식물로 발달하게 되는 원인으로는 핵내유사분열(Endomitosis)이나 내재복제(Endoreduplication)의 결과라고 보고된 바 있다(Keller and Armstrong 1979). 또한, Shumilina 등(2020)은 소포자 배양 시 2차배 형성이 진행되게 되면 추가적인 배양 기간 동안 세포의 염색체가 2배가 되게 하고, 이 중 염색체가 배가된 세포가 더 빨리 배아로 발달되게 되어 자발적인 염색체 배가식물체 비율이 증가한다고 보고하였다. 본 연구 결과 또한 소포자 배 발달 후 캘러스를 생성하고 2차배가 발생하는 과정에서 자발적인 염색체 배가 과정을 거쳐 배가반수체 식물체 비율이 기존 연구결과와 유사하게 66.7%로 나타난 것으로 판단된다.

유채 배가반수체 계통에서 지방산 조성 분석

이식된 식물체 중 종실을 수확할 수 있는 계통은 4배체 계통 뿐이었으며, 총 62계통을 수확하였다. 반수체인 2배체나 8배체 식물체에서는 후대 종자를 얻기 위해 자가 수분을 실시하였을 때, 꼬투리는 형성되었으나 종실이 발달하지 못해 임성이 회복되지 않았다. 반수체나 배수성이 커진 식물체에서 임성을 회복하지 못하는 결과는 배추, 청경채(Brassica compestris L.) 등에서도 유사하게 보고된 바 있다(Kim et al. 2019; Seo et al. 2014).

수확된 4배체 62계통과 모부본, F1 계통까지 총 65계통을 대상으로 지방산 분석을 실시하여 C18 지방산 중 주요 불포화지방산 비율을 조사하였다(Fig. 6). 동일한 조건의 온실에서 재배 후 분석한 모본 EMS26 계통의 올레산 비율(C18:1)은 76.1%였으며, 부본인 J8634-B-30 계통에서는 63.1%, 두 계통의 F1 계통은 72.3%였다. DH 계통의 평균 올레산 비율은 72.3%였으며 DH76 계통에서 61.6%로 가장 낮은 값을 보였고, DH22계통에서 77.6%로 가장 높게 나타났다 리놀레산(C18:2)은 EMS26계통에서 9.7%, J8634-B-30 계통에서 20.6%, F1 계통 13.1%, DH 계통 평균은 11.8%였다. 또한 리놀렌산(C18:3)의 비율은 EMS26계통에서 6.2%, J8634-B-30 계통 8.8%, F1 계통 10.1%였다. DH계통의 리놀레산 비율 평균은 8.0%였으며, DH109계통에서 5.0%로 가장 낮았으며 DH19계통에서 13.4%로 가장 높았다.

Fig. 6. Unsaturated C18 fatty acids measured in rapeseed DH lines derived from the cross of EMS26and X J8634-B-30. Fatty acid levels were measured as a percentage of the total oil content. The black arrow indicated the fatty acid level in parental and Fl lines

올레산에서 리놀레산으로의 전환 과정은 소포체(Endoplasmic reticulum)와 색소체(Plastid)에서 불포화 효소에 의해 이루어진다(Javidfar et al. 2006; Scheffler et al. 1997). 리놀렌산 역시 리놀레산에 불포화 반응을 통해 전환된다. 이에 올레산 함량이 높게 육종된 유채에서는 불포화 효소의 기능이 저하되어 리놀레산과 리놀렌산 함량이 낮아진다고 보고되었다(Gacek et al. 2017; Yan et al. 2011). 우리의 결과 또한 올레산 비율이 가장 높은 DH22 계통에서 리놀레산 비율이 7.7%로 가장 낮았다. 또한 C18 지방산의 주요 불포화지방산에서 모두 모부본을 초과하는 초월분리(Transgressive segregation) 현상을 보였다. 모부본보다 높은 올레산 비율을 보이는 계통은 5개였으며, 리놀렌산에서는 14계통이었다. 유채에서 올레산 비율이 높은 계통과 낮은 계통을 교배하여 DH (Doubled haploid)와 RIL (Recombinant inbred line) 후대 집단을 분석한 결과 올레산과 리놀렌산 비율에서 초월분리 현상을 보인 결과는 각각 Javidfar 등(2006)Yan 등(2011)이 보고한 바 있다. 특히 Javidfar 등(2006)은 우리의 결과와 유사하게 올레산에 비해 리놀렌산에서 초월분리 현상을 보인 계통 수가 더 많이 관찰되었다고 보고하였다.

본 연구 결과, 올레산 함량이 높은 EMS26계통과 J8634-B-30계통의 잡종 1세대에서 소포자 배양에 적정한 꽃봉오리 크기를 확인하였으며, 소포자 배 형성 후 캘러스, 2차배 발달 과정을 거쳐 식물체를 확보하였다. 확보한 식물체의 66.7%가 4배체였으며, 식물체의 배수성과 세포 크기의 정의 상관관계를 확인하였다. 4배체 배가반수체 집단의 지방산 조성을 모부본과 비교한 결과, 올레산과 리놀렌산 모두 초월분리 현상을 보였으며 특히 리놀렌산에서 모부본의 함량보다 높은 계통이 더 많이 관찰되었다. 이렇게 확보된 배가반수체 유전 집단은 올레산 함량 증가와 관련한 기작 및 유전자 탐색의 자료로써 이용이 가능할 것으로 기대된다. 또한 높은 올레산, 리놀렌산 함량을 보인 계통은 고급 유채유 생산을 위한 품종 육종 소재로도 활용할 계획이다.

적 요

유채(Brassica napus)는 배추와 양배추의 자연 교잡에 의해 만들어진 이질사배체 작물(AACC, 2n = 38)로, 유채유를 생산하는 기름 작물이다. 본 연구에서는 올레산 함량이 높은 유채 EMS26 계통과 J8634-B-30 계통의 잡종 1세대 소포자를 이용하여 배양을 실시하였고, 재분화 식물체의 배수성을 검정하고 배가반수체 집단을 선발하여 C18 지방산 조성을 분석하였다. 먼저 꽃봉오리의 크기에 따른 소포자 발달 단계를 확인하였으며, 소포자 배 발생 효율이 높은 1핵기 말과 2핵기 발달 단계를 보이는 꽃봉오리 크기는 2.6~3.5 mm였다. 본 크기의 꽃봉오리만을 이용하여 소포자 배양을 실시하였으며, 배양 10일 후에 구형배와 심장형배가 관찰되었다. 소포자배는 캘러스를 형성하여 2차배로 발달하였으며, 이후 발달된 multilobe로부터 108 계통의 재분화 식물체를 획득하였다. 재분화된 식물체의 배수성은 4배체가 66.7% (72계통)로 다수였으며, 8배체는 27.8% (30계통), 그리고 2배체는 5.6% (6계통)로 확인되었다. 각 배수성에 따른 기공 세포의 크기는 4배체, 8배체, 2배체 각각 25.5 μm, 35.6 μm, 19.9 μm로 나타나, 배수성과 세포 크기는 정의 상관관계를 보였다. 이중 4배체 배가반수체 식물체 62계통을 선별하여 지방산 조성을 분석한 결과, 평균 올레산(C18:1) 함량은 72.3%, 리놀레산(C18:2) 11.8%, 리놀렌산(C18:3) 6.2%로 나타났다. 특히 올레산 함량이 가장 높은 계통은 DH22 계통으로 77.6%였으며, 리놀렌산 함량은 DH19계통에서 13.4%로 가장 높았다. 또한 모부본 보다 높은 올레산과 리놀렌산 함량을 보이는 계통은 각각 5개와 14개로 초월 분리(Transgressive segregation) 현상을 보였다. 이렇게 확보된 배가반수체 유전 집단은 유채의 불포화 지방산 생합성 기작 및 관련 유전자 탐색에 활용 가능하며, 올레산 함유량이 높은 계통들은 고품질 유채유 생산 품종 육종 소재로 활용 될 수 있을 것으로 기대된다.

사 사

본 연구는 농촌진흥청 작물시험연구사업(과제번호: PJ01 433201)의 지원에 의해 수행되었다.

Figures
Fig. 1. Nuclear development stage of microspore according to the flower bud sizes of rapeseed F1. Binucleate stage presenting vegetative and generative nuclei. Trinucleate stage presenting one vegetative and two generative nuclei
Fig. 2. Embryogenesis from the isolated microspore culture of rapeseed F1. (A) Isolated microspores. (B) Embryogenesis derived from microspores after 2 days of culture. (C and D) Globular-stage embryo after 10 days of culture. (E and F) Maturated embryo after 2 days of culture in light acclimation
Fig. 3. Shoot regeneration derived from the embryo. (A) First early shoot and root formation derived from the embryo. (B) Multilobe formation from the secondary embryo. (C) Shoot formation from the multilobe. (D) Regenerated plantlet
Fig. 4. Flow cytometric analyses (A) and stomatal cell (B) of rapeseed lines from the isolated microspore culture of F1. (A) The ploidy of each peak is indicated on top. (B) The white line indicated 30 μm
Fig. 5. Stomatal size versus ploidy level in rapeseed lines from the isolated microspore culture of F1. The black dot line indicated the trend line
Fig. 6. Unsaturated C18 fatty acids measured in rapeseed DH lines derived from the cross of EMS26and X J8634-B-30. Fatty acid levels were measured as a percentage of the total oil content. The black arrow indicated the fatty acid level in parental and Fl lines
Tables
Table. 1.

Ploidy and stomatal size of rapeseed lines from the isolated microspore culture of F1

Line Ploidy Stomatal size (μm) Line Ploidy Stomatal size (μm) Line Ploidy Stomatal size (μm)
DH1 4 22.3±0.36 DH37 4 22.4±0.34 DH74 4 27.0±0.25
DH2 4 28.4±0.20 DH38 4 30.6±0.43 DH75 8 29.9±0.53
DH3 4 26.3±0.22 DH39 8 41.2±0.40 DH76 4 24.4±0.35
DH4 4 25.2±0.71 DH40 4 30.5±0.23 DH77 4 26.3±0.28
DH5 4 25.4±0.22 DH41 8 29.7±0.29 DH78 8 27.2±0.85
DH6 8 37.9±0.67 DH42 4 29.8±1.19 DH79 2 27.7±0.29
DH7 8 35.3±0.68 DH43 4 25.4±0.24 DH80 4 25.9±0.23
DH8 8 35.6±0.42 DH44 4 24.6±0.31 DH81 8 41.2±1.06
DH9 4 26.3±0.91 DH45 8 28.1±0.97 DH82 8 44.4±0.31
DH10 4 19.0±0.63 DH46 4 23.5±0.28 DH83 4 28.6±0.35
DH11 4 25.8±0.24 DH47 4 23.7±0.45 DH84 8 37.8±0.73
DH12 8 36.2±0.43 DH48 4 29.7±0.11 DH85 4 27.1±0.41
DH13 4 23.4±0.20 DH49 4 26.1±0.56 DH86 4 25.5±0.32
DH14 4 24.4±0.25 DH50 8 30.0±0.30 DH87 4 25.1±0.35
DH15 2 20.1±0.20 DH51 2 12.2±0.30 DH88 4 26.3±0.34
DH16 8 36.9±1.42 DH52 4 26.0±0.33 DH89 8 45.1±0.67
DH17 4 22.6±0.25 DH53 8 34.1±0.47 DH90 8 34.1±0.58
DH18 4 24.3±0.11 DH54 4 25.8±0.23 DH91 2 17.9±0.61
DH19 4 24.6±0.54 DH55 4 27.5±0.30 DH92 4 23.6±0.06
DH20 4 23.7±0.15 DH56 4 22.3±0.16 DH93 4 21.4±0.36
DH21 8 32.3±1.04 DH57 4 21.7±0.25 DH94 4 30.4±0.21
DH22 4 25.7±0.33 DH58 4 29.7±0.36 DH95 4 26.0±0.37
DH23 4 25.0±0.29 DH59 4 24.5±0.51 DH96 4 28.3±0.34
DH24 8 34.7±0.08 DH60 8 29.4±0.64 DH97 8 40.1±0.27
DH25 4 22.3±0.29 DH61 4 18.3±0.05 DH98 4 26.4±0.35
DH26 8 25.5±0.38 DH62 4 24.3±0.29 DH99 4 29.1±0.22
DH27 4 27.7±0.12 DH63 8 36.5±0.22 DH100 4 26.2±0.33
DH28 4 24.6±0.18 DH64 4 31.2±0.51 DH101 4 25.0±0.36
DH29 4 27.3±0.27 DH65 8 37.2±0.36 DH102 8 50.4±0.45
DH30 4 24.6±0.24 DH66 4 21.9±0.28 DH103 8 23.9±0.82
DH31 2 21.8±0.26 DH67 4 31.5±0.35 DH104 4 26.1±0.20
DH32 4 22.7±0.19 DH68 4 23.2±0.40 DH105 4 32.8±0.76
DH33 8 36.8±0.34 DH69 4 27.0±0.33 DH106 2 20.0±0.36
DH34 8 39.6±0.54 DH70 4 25.3±0.70 DH107 4 26.0±0.41
DH35 8 36.5±0.35 DH72 4 22.9±0.53 DH109 4 18.7±0.50
DH36 4 22.9±0.46 DH73 8 40.8±0.68 DH110 4 26.1±0.89

References
  1. Atri C, Banga S (2016) A protocol for flow cytometric determination of expected chromosome number of Brassica juncea L. introgression lines. Journal of Oilseed Brassica 1(2): 170-174
  2. Browse J, Spychalla J, Okuley J, Lightner J (1998). Altering the Fatty Acid Composition of Vegetable Oils. NY: Cambridge University Press, New York
  3. Chalhoub B, Denoeud F, Liu S, Parkin IA, Tang H, Wang X, Chiquet J, Belcram H, Tong C, Samans B (2014) Early allopolyploid evolution in the post-Neolithic Brassica napus oilseed genome. Science 345(6199): 950-953
    Pubmed CrossRef
  4. Chang NW, Huang PC (1998) Effects of the ratio of polyunsaturated and monounsaturated fatty acid to saturated fatty acid on rat plasma and liver lipid concentrations. Lipids 33(5): 481-487
    Pubmed CrossRef
  5. Datta SK (2001). Current trends in the embryology of angiosperms. Springer, pp 471-488
    CrossRef
  6. Forster BP, Thomas WT (2005) Doubled haploids in genetics and plant breeding. Plant Breed Rev 25: 57-88
    Pubmed CrossRef
  7. Gacek K, Bayer PE, Bartkowiak-Broda I, Szala L, Bocianowski J, Edwards D, Batley J (2017) Genome-wide association study of genetic control of seed fatty acid biosynthesis in Brassica napus. Frontiers in Plant Science 7: 2062
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  8. Guha S, Maheshwari SC (1964) In vitro production of embryos from anthers of Datura. Nature 204(4957): 497-497
    CrossRef
  9. Höfer M (2004) In vitro androgenesis in apple-improvement of the induction phase. Plant Cell Reports 22(6): 365-370
    Pubmed CrossRef
  10. Hu X, Sullivan-Gilbert M, Gupta M, Thompson SA (2006) Mapping of the loci controlling oleic and linolenic acid contents and development of fad2 and fad3 allele-specific markers in canola (Brassica napus L.). Theoretical and Applied Genetics 113(3): 497-507
    Pubmed CrossRef
  11. Jang YS, Min K, Oh Y, Chung D (1997) Comparisons of developmental stages of microspore by bud size and embryogenesis from its microspore in Brassica species. Korean J Breed 29(4): 480-485
  12. Javidfar F, Ripley V, Roslinsky V, Zeinali H, Abdmishani C (2006) Identification of molecular markers associated with oleic and linolenic acid in spring oilseed rape (Brassica napus). Plant Breeding 125(1): 65-71
    CrossRef
  13. Keller W, Armstrong K (1979) Stimulation of embryogenesis and haploid production in Brassica campestris anther cultures by elevated temperature treatments. Theoretical and Applied Genetics 55(2): 65-67
    Pubmed CrossRef
  14. Kim JS, Seo MS, Moon MS, Won SY, Kwon SJ (2019) Insight on doubled haploid production with an amphidiploid species 'Dolsangat' in Brassica Juncea. Korean Society of Breeding Science 51(4): 341-350
    CrossRef
  15. Kim KS, Lee YH, Cho HJ, Jang YS, Park KG (2012) Effects of culture condition on embryogenesis in microspore culture of Brassica napus L. domestic cultivar 'Tammiyuchae'. Korean Journal of Crop Science 57(4): 317-323
    CrossRef
  16. Kim KS, Li MY, Jang YS, Park YJ, Bang JK (2008) Production of haploids from proton ion and gamma-ray irradiation treated M2 generation of isolated microspores in Brassica napus L. ssp. oleifera. Korean Journal of Crop Science 53(2): 150-155
  17. Kyo M, Harada H (1985) Studies on conditions for cell division and embryogenesis in isolated pollen culture of Nicotiana rustica. Plant physiology 79(1): 90-94
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  18. Lee TS, Lee YH, Kim KS, Lee HK, Jang YS, Choi IH, Kim KS (2014) Effect of sowing time on oil content and fatty acid composition characteristics in rapeseed cultivars. Korean Journal of Plant Resources 27(2): 202-208
    CrossRef
  19. Licher R (1982) Induction of haploid plants from isolated pollen of Brassica napus. Zeitschrift für Pflanzenphysiologie 105(5): 427-434
    CrossRef
  20. Long W, Hu M, Gao J, Chen S, Zhang J, Cheng L, Pu H (2018) Identification and functional analysis of two new mutant BnFAD2 alleles that confer elevated oleic acid content in rapeseed. Frontiers in Genetics 9: 399
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  21. Mohammadi PP, Moieni A, Ebrahimi A, Javidfar F (2012) Doubled haploid plants following colchicine treatment of microspore-derived embryos of oilseed rape (Brassica napus L.). Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC) 108(2): 251-256
    CrossRef
  22. Murashige T, Skoog F (1962) A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol Plant 15: 473-497
    Pubmed CrossRef
  23. Na H, Kwak JH, Chun C (2011) The effects of plant growth regulators, activated charcoal, and AgNO3 on microspore derived embryo formation in broccoli (Brassica oleracea L. var. italica). Horticulture, Environment, and Biotechnology 52(5): 524
    CrossRef
  24. Nakata K, Tanaka M (1968) Differentiation of embryoids from developing germ cells in anther culture of tobacco. Japanese Journal of Genetics 43(1): 65-70
    CrossRef
  25. Ouyang TW, Hu H, Chuang CC, Tseng CC (1973) Induction of pollen plants from anthers of Triticum aestivum L. cultured in vitro. Scientia Sinica 16(1): 79-90
  26. Park YJ, Kim KS, Jang YS, Kim CW, Bang JK (2006) Comparison of frequency embryogenesis through microspore culture of domestic cultivars in Brassica napus L. Korean Journal of Crop Science 51(1): 237-241
  27. Przybylski R, Gruczynska E, Aladedunye F (2013) Performance of regular and modified canola and soybean oils in rotational frying. Journal of the American Oil Chemists'. Society 90(9): 1271-1280
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  28. Scheffler J, Sharpe A, Schmidt H, Sperling P, Parkin I, Lühs W, Lydiate D, Heinz E (1997) Desaturase multigene families of Brassica napus arose through genome duplication. Theoretical and Applied Genetics 94(5): 583-591
    CrossRef
  29. Seo MS, Sohn SH, Park BS, Ko HC, Jin M (2014) Efficiency of microspore embryogenesis in Brassica rapa using different genotypes and culture conditions. Journal of Plant Biotechnology 41(3): 116-122
    CrossRef
  30. Shumilina D, Kornyukhin D, Domblides E, Soldatenko A, Artemyeva A (2020) Effects of genotype and culture conditions on microspore embryogenesis and plant regeneration in Brassica Rapa ssp. Rapa L. Plants 9(2): 278
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  31. Siebel J, Pauls K (1989) A comparison of anther and microspore culture as a breeding tool in Brassica napus. Theoretical and Applied Genetics 78(4): 473-479
    Pubmed CrossRef
  32. Tatum T, Nunez L, Kushad M, Rayburn A (2006) Genome size variation in pumpkin (Cucurbita sp.). Annals of applied biology 149(2): 145-151
    CrossRef
  33. Thomas E, Wenzel G (1975) Embryogenesis from microspores of Brassica napus. Z Pflanzenzüchtg 74: 77-81
    Pubmed CrossRef
  34. Thomson JA, Alonso-Amelot ME (2002) Clarification of the taxonomic status and relationships of Pteridium caudatum (Dennstaedtiaceae) in Central and South America. Botanical Journal of the Linnean Society 140(3): 237-248
    CrossRef
  35. Weber S, Ünker F, Friedt W (2005) Improved doubled haploid production protocol for Brassica napus using microspore colchicine treatment in vitro and ploidy determination by flow cytometry. Plant Breeding 124(5): 511-513
    CrossRef
  36. WHO (2003) Diet, nutrition and the prevention of chronic diseases. World Health Organ Tech Rep Ser 916(i-viii): 1-149
    Pubmed CrossRef
  37. Yan XY, Li JN, Wang R, Jin MY, Chen L, Qian W, Wang XN, Liu LZ (2011) Mapping of QTLs controlling content of fatty acid composition in rapeseed (Brassica napus). Genes & Genomics 33(4): 365-371
    CrossRef
  38. Yang Q, Fan C, Guo Z, Qin J, Wu J, Li Q, Fu T, Zhou Y (2012) Identification of FAD2 and FAD3 genes in Brassica napus genome and development of allele-specific markers for high oleic and low linolenic acid contents. Theoretical and Applied Genetics 125(4): 715-729
    Pubmed CrossRef

June 2022, 49 (2)
Full Text(PDF) Free

Social Network Service
Services

Cited By Articles
  • CrossRef (0)

Funding Information
  • CrossMark
  • Crossref TDM